线粒体既是细胞的能量工厂，又参与调节细胞的氧化还原和稳态维持。与此相应，线粒体的代谢适能（metabolic fitness）或功能失衡（mitochondrial dysfunction）与机体和组织的健康或多种疾病和衰老的发生有着直接和密切的关联。其中，线粒体中三羧酸循环、电子呼吸链等所参与的氧化代谢及其调控是其功能态的核心环节。然而，由于氧化代谢的水平和氧化还原状态各异，氧化代谢的提升还可能导致氧化损伤的增加，如何在生理条件下的组织和细胞中界定和追踪线粒体代谢适能的“健康态”，并针对性地探寻与之相关的质量控制以及应激调控机制，可能是回答一系列重要科学问题的关键契入点，亟待进行深入研究并寻求突破。

Timer是一个早年建立的荧光光谱可在一定时间内发生特定转换的荧光蛋白（定义为由绿色荧光转换为红色荧光），MitoTimer则是能够定位于线粒体基质的Timer蛋白。将Timer（MitoTimer）在细胞中表达后，虽然Timer的两种荧光光谱似乎能反映细胞（或线粒体）中“新”、“老”Timer蛋白的构成，但其整体荧光光谱（红绿比）可能受到多种因素的影响，Timer的这种随时间改变光谱的特性或Timer的荧光光谱用于研究生物学过程的最佳场景尚不明确。医学院模式动物研究所的刘耕课题组通过建立MitoTimer的小鼠报告系统并解析生理稳态下小鼠骨骼肌中MitoTimer的荧光光谱，首次发现处于不同氧化代谢水平的骨骼肌组织和肌纤维中MitoTimer荧光光谱存在巨大差异（如：氧化代谢旺盛的慢肌纤维以绿色荧光为主，而以糖酵解为主要代谢模式的快肌纤维则以红色荧光为主）。同时，年轻小鼠以及锻炼后小鼠骨骼肌MitoTimer均呈现偏绿荧光光谱。在细胞体系中，提升氧化代谢水平同样能促进MitoTimer偏绿光谱的呈现。进一步的研究排除了线粒体自噬以及生物合成等多种因素对氧化状态下MitoTimer荧光光谱的影响，揭示线粒体基质蛋白水解酶的活力直接影响了MitoTimer的降解速率，尤其是MitoTimer红色荧光的强度，是决定MitoTimer荧光光谱的主要因素，而这种“新”、“老”蛋白降解动力学的内在区别可能正是Timer特性的在活细胞中的反映。重要的是，线粒体蛋白酶活力、MitoTimer以及线粒体呼吸链蛋白降解和更新都与线粒体能量状态和水平紧密偶联。因此，偏绿的MitoTimer荧光光谱界定和指示了线粒体的一种活跃状态，即特定氧化代谢状态下供能效率的提升（高氧化磷酸化水平）。线粒体蛋白酶作为线粒体重要的质量控制系统，负责线粒体电子传递链蛋白复合体的组装以及损伤蛋白的清除等功能，因此该研究的发现提示线粒体高氧化磷酸化状态存在正向反馈的维持机制。更多实验结果也证实这种线粒体的活跃状态反而伴随着较低活性氧/氧化损伤以及线粒体自噬水平，显示出线粒体代谢适能的特定状态。综上，MitoTimer偏绿荧光光谱的解析揭示了与线粒体高水平氧化磷酸化状态相偶联的质量控制机制，并指示高效而低氧化损伤的特定线粒体活跃状态。

有趣的是，这项研究还发现多种与长寿相关而作用机制或靶点不尽相同的药物均能够提升线粒体氧化磷酸化水平和蛋白水解酶活力, 促进MitoTimer偏绿荧光的呈现。因此，线粒体代谢适能状态可能成为研究氧化代谢质量控制和调控机制的重要范式，该状态的标记和示踪也有助于抵抗退行性疾病和衰老药物的研发。近期，以上研究结果以“The coupling of mitoproteolysis and oxidative phosphorylation enables tracking of an active mitochondrial state through MitoTimer fluorescence”为题在线发表在Redox Biology杂志（https://doi.org/10.1016/j.redox.2022.102447），南京大学博士后解茵茵、博士生张燕南、硕士生孙爱娜为共同第一作者，南京大学刘耕教授为通讯作者。该研究得到科技部863计划、科技部重点研发计划以及国家自然科学基金的支持。