心脏搏动过程中，心肌细胞中钙离子在细胞浆与肌浆网之间穿梭是实现心肌兴奋-收缩耦联的关键步骤，这一过程发生紊乱会导致包括心衰在内的诸多心脏疾病（1）。因此，在由于细胞浆／肌浆网钙穿梭异常导致的心脏疾病治疗中，恢复心肌细胞的钙稳态是一种非常诱人的药物研发策略。心肌细胞中，SERCA2a是一个位于肌浆网上的钙－ATP酶，其主要功能是通过水解ATP介导钙离子从细胞浆到肌浆网内的转运，从而控制心肌舒张（2）。在成熟的小鼠心肌细胞中，大约95%的胞浆钙离子是由SERCA2a重新回收到肌浆网内的（3）。SERCA2a表达量或活性降低都延迟会肌浆网对钙离子的重回收，进而导致肌肉舒张／收缩减弱（4）。因此，以SERCA2a为分子靶点恢复心肌细胞钙稳态、进而治疗心衰等心脏疾病具有非常大的前景。然而，SERCA2a功能调控机制到目前为止尚不十分清楚，而此类调控机制的解析有助于为以SERCA2a为靶点进行药物研发提供新思路。
2018年12 月19日，南京大学模式动物研究所陈帅教授团队在国际主流期刊《Circulation Research》上在线发表题为“SPEG Controls Calcium Re-uptake Into The Sarcoplasmic Reticulum Through Regulating SERCA2a By Its Second Kinase-Domain ”的论文（5）。该研究从蛋白质组学入手，发现SERCA2a可以与横纹肌特异性表达的蛋白激酶（SPEG）相互作用；通过一系列深入研究证明了SPEG是SERCA2a的一个全新调控因子，可调控钙离子在细胞浆与肌浆网之间的穿梭（图一）。这项研究揭示了心脏钙稳态调控的一种新机制，为钙稳态异常导致的心脏疾病的发病机理及治疗提供了新思路。
SPEG属于肌球蛋白轻链激酶（MLCK）亚组钙调蛋白激酶（CaMK）丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员。其C端含有两个串联的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，其第一个激酶结构域与MLCK亚组的其他成员具有更高的同源性。之前有研究表明，SPEG不仅是心脏发育所必需的、也是维持成年小鼠心脏功能所必不可少的；但是到目前为止仍然不清楚SPEG是如何来调控心脏功能的。
在本篇研究中，陈帅教授团队首先通过蛋白质组学分析鉴定出SERCA2a是潜在的可以与SPEG发生相互作用的蛋白。研究人员利用免疫共沉降（Co-IP）实验证明无论在体内还是体外，SPEG与SERCA2a都存在相互作用。随后通过在细胞系以及新生大鼠原代心室心肌细胞（NRVC）中进行一系列的实验，他们发现SPEG的第二个激酶结构域可以与SERCA2a相互作用、并直接磷酸化SERCA2a的Thr484位点，进而促进SERCA2a的寡聚化，最终增强SERCA2a转运钙离子的能力。
小干扰RNA（siRNA）是一种常见的基因沉默工具，进入细胞后可以引发相应基因的信使RNA（mRNA）快速降解。利用siRNA在NRVC敲降SPEG后，SERCA2a-Thr484 的磷酸化水平及肌浆网的钙离子回流都受到了抑制，说明SPEG可以调控SERCA2a的功能。此外，将SERCA2a的Thr484位点突变成不能磷酸化的丙氨酸（Ala）后，相较于野生型SERCA2a而言, 过表达SERCA2aThr484Ala突变蛋白的NRVC中肌浆网钙离子回流时间延长，进一步说明该磷酸化位点是SERCA2a的关键活性调控位点。
为进一步研究SPEG-SERCA2a这一轴线的在体功能，陈帅教授团队利用Cre-loxp系统在成年小鼠心脏中特异性敲除Speg基因。与对照小鼠相比，SPEG心脏特异性敲除小鼠罹患严重的扩张型心肌炎，心功能显著降低、并随时间推移不断恶化，最终过早死亡。他们的机制研究显示，缺失SPEG的小鼠心脏中SERCA2a-Thr484 的磷酸化水平以及寡聚化都显著降低；最为重要的是，在SPEG心脏特异性敲除小鼠的心功能发生异常之前，其心肌细胞中肌浆网的钙离子回流已经受到抑制。这些结果表明，SPEG-SERCA2a调控轴线具有重要的在体功能，SERCA2a功能受损是SPEG心脏特异性敲除小鼠发生心衰的重要原因。
综上，该项研究发现了心肌细胞中SERCA2a功能调控的全新机制，并且阐明了SPEG是恢复心肌细胞钙稳态以及心衰等心脏疾病治疗的新的分子靶标。
南京大学模式动物研究所博士生全超和李敏为本文共同第一作者，南京大学陈帅教授为本文通讯作者。
图一 SPEG-SERCA2a轴线调控心肌细胞钙离子稳态与心功能
1. Braunwald E. The war against heart failure: The lancet lecture. Lancet. 2015;385:812-824
2. Gorski PA, Ceholski DK, Hajjar RJ. Altered myocardial calcium cycling and energetics in heart failure--a rational approach for disease treatment. Cell Metab. 2015;21:183-194
3. Bassani, R.A. and J.W. Bassani, Contribution of Ca(2+) transporters to relaxation in intact ventricular myocytes from developing rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002. 282(6): p. H2406-13
4. Kho C, Lee A, Hajjar RJ. Altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling--targets for heart failure therapy. Nat Rev Cardiol. 2012;9:717-733
5. Quan C, Li M , et al. SPEG Controls Calcium Re-Uptake into the Sarcoplasmic Reticulum Through Regulating SERCA2a by Its Second Kinase-Domain. Circ Res, Originally published 19 Dec 2018 |https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.118.313916
